Освоение техники приготовления мазка из агаровой культуры бактерий и окраски его простым способом
Этапы приготовления мазка:
1. Препараты для микроскопического исследования готовят на чистых предметных стеклах, обезжиривая их поверхность мылом с последующим его удалением сухой негигроскопичной ватой. Наносят на обезжиренную поверхность стекла каплю воды (на хорошо обезжиренном стекле капля растекается).
2. Бактериальную петлю, изготовленную из платиновой, нихромовой или никелиновой проволоки стерилизуют прокаливанием докрасна в пламени горелки, держа ее в пламени сначала вертикально, а затем горизонтально, после чего обжигают примыкающую к петле часть держателя. Стерильную петлю используют для взятия микробной массы, держа ее в правой руке, как карандаш. Пробирку или колбу с питательной средой берут в левую руку так, чтобы поверхность с ростом культуры была обращена вверх, вынимают пробку из сосуда мизинцем правой руки, прижимая ее к ладони. Края сосуда обжигают в пламени горелки, вводят в него прокаленную петлю, прикасаясь ею к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от роста микроорганизмов, с целью охлаждения петли. Захватывают небольшое количество микробной массы, равномерно эмульгируя ее в капле воды в виде кружка или овала диаметром около 1 см. Если микроорганизмы выращены на жидкой питательной среде, культуру наносят на стекло петлей или стерильной пипеткой. После работы пипетку дезинфицируют 3—5% раствором фенола, остатки культуры на петле сжигают в пламени горелки и ставят петлю вертикально в штатив или специальный стакан. Тонкий и равномерный по толщине препарат можно получить, используя методику приготовления мазка крови. Для этого к капле жидкости или крови, нанесенной к концу стекла, подводят край шлифованного стекла под углом в 45°, капля растекается по краю этого стекла, после чего делают мазок быстрым движением шлифованного стекла. Мазок высушивают на воздухе.
3. Высушенный мазок в целях умерщвления микробных клеток и прикрепления их к стеклу фиксируют. Обычно применяют физический метод — фиксацию мазка над пламенем горелки или спиртовки троекратно (по 1 сек) мазком вверх. Правильно зафиксированный препарат, приложенный к тыльной стороне кисти, вызывает чувство выраженного тепла, но не жжения. Ни в коем случае стекло не следует перегревать и не подвергать фиксации влажный мазок. Это приводит к деформации и резкому уменьшению размеров и без того мелкого объекта исследования. Химический метод фиксации более щадящий. Используют этанол (10—15 мин), ацетон (5 мин), смесь Никифорова (смесь равных объемов этанола и эфира—10— 15 мин), метанол (3 мин), пары осмиевой кислоты, формалин (несколько секунд).
4. Окраска препарата простым способом: на мазок при помощи пипетки наносят 2-3 капли растворов водного фуксина (1-2 мин.), метиленового синего (3-5 мин.) или иного красителя. По окончании окрашивания мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Изучение морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов в препаратах, приготовленных из материала от больного, лежит в основе бактериоскопического метода исследования. Этот метод широко используется в диагностике чумы, туберкулеза, гонореи, сифилиса и ряда других заболеваний.
Источник
Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов
Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.
Приготовление мазка. При приготовлении мазка из культуры микроорганизмов, выросшей на поверхности плотной питательной среды, на обезжиренное предметное стекло наносят петлёй небольшую каплю физиологического раствора, располагая её в центре круга, нарисованного с обратной стороны карандашом по стеклу. При работе спиртовка должна находиться прямо перед вами, на удобном для работы расстоянии. Предметное стекло должно находиться в чашке Петри или лотке: категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! В правую руку берут бактериологическую петлю, в левую — пробирку с культурой. Петлю стерилизуют, внося её в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля накалится докрасна, проводят конец петледержателя через пламя. После этого из пробирки вынимают пробку, удерживая её мизинцем правой руки. После обжигания на спиртовке края пробирки в неё вносят петлю, которую охлаждают, прикасаясь к стенкам пробирки. Затем петлёй с поверхности среды снимают небольшое количество культуры. Не касаясь стенок пробирки, вынимают петлю и закрывают пробирку пробкой над спиртовкой. После этого пробирку с культурой помещают в штатив, а культуру на петле вносят в приготовленную заранее каплю физиологического раствора, хорошо размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого круга или овала 1–1,5 см в диаметре. По окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют в пламени спиртовки.
Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло наносят 1–2 петли исследуемого материала, стерилизуя петлю перед каждым погружением в бульонную культуру микроорганизма, как описано выше, и равномерно распределяют по стеклу (в этом случае не требуется предварительного нанесения на стекло физиологического раствора).
Высушивание мазка. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращённым кверху, можно подержать в струе тёплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.
Фиксация мазка. Для этого используют физический и химический методы. Физический метод заключается в фиксации мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх (троекратно по 1 секунде). Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок, так как при перегревании могут произойти необратимые изменения в клетке. Химический метод фиксации является более мягким по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (эквивалентное соотношение этанола и эфира), метанол, формалин. После фиксации мазок можно окрашивать.
Окраска мазка. Для окраски мазка следуют предписаниям для каждой методики окраски. При окраске простым способом на мазок наносят несколько капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт им. Краситель оставляют на определённое время. Затем препарат промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.
Источник
Приготовить препарат мазок с агаровой бульонной культуры
Министерство здравоохранения Республики Беларусь Витебский государственный медицинский университет Кафедра микробиологии
по общей микробиологии для студентов II курса стоматологического факультета
Рецензенты : профессор кафедры инфекционных болезней ВГМУ М.Л.Доценко; доцент кафедры инфекционных болезней ВГМУ Т.И.Дмитраченко
Генералов И.И. с соавт.
М ___ Методические указания по общей микробиологии для студентов II курса стоматологического факультета / Генералов И.И. с соавт. — Витебск, —
Авторы: Генералов И.И., Железняк Н.В., Данющенкова Н.М., Окулич В.К.
Методические указания разработаны в соответствии с учебным планом для специальности М.02.01.00 «Стоматология» и требованиями к квалификации врача-стоматолога. Предназначены для студентов стоматологических факультетов высших медицинских учебных заведений.
Утверждены и рекомендованы к изданию Центральным учебно-методическим Советом Витебского государственного медицинского университета (Протокол №___ от ___ июня 2002 г .)
© Генералов И.И.. с соавт.
© Витебский государственный медицинский университет, 2002
ЗАНЯТИЕ №1 . Устройство и оборудование микробиологической лаборатории. Правила
работы. Систематика и номенклатура микроорганизмов. Морфология бактерий. Микроскопический метод исследования. Простые методы
ЗАНЯТИЕ №2. Морфология и структура прокариотов. Сложные
ЗАНЯТИЕ №3. Морфология и структура прокариотов. Сложные
методы окраски (продолжение).
ЗАНЯТИЕ №4. Морфология и структура прокариотов (спирохеты, риккетсии, хламидии,
микоплазмы). Эукариоты (грибы и простейшие). Выделение чистой
культуры аэробных бактерий (1 день исследования)
Физиология микроорганизмов. Питание, питательные среды. Рост,
размножение, пигментообразование бактерий. Выделение чистой культуры
аэробных микробов (2-й день исследования)
Физиология микроорганизмов. Дыхание бактерий. Ферменты бактерий.
Изучение биохимических свойств чистой культуры выделенных
Экология микроорганизмов. Влияние физических, химических и
биологических факторов на микрофлору. Стерилизация. Асептика.
Экология микроорганизмов. Микрофлора тела человека, ее роль.
Санитарно-бактериологическое исследование смыва с рук. Микрофлора
воздуха. Сан.-бактериологическое исследование воздуха
ЗАНЯТИЕ №9. Экология микроорганизмов. Микрофлора воды, почвы. Санитарно-
бактериологическое исследование воды. Санитарно-бактериологическое
исследование смыва с рук (продолжение).
ЗАНЯТИЕ №10 . Микробиология полости рта.
ЗАНЯТИЕ №11 . Иммунитет. Виды иммунитета. Системы иммунитета. Лимфоидная
система. Система мононуклеарных фагоцитов.
ЗАНЯТИЕ №12. Иммунитет. Антигены. Реакции иммунитета: механизм. Реакция
агглютинации, пассивной гемагглютинации.
ЗАНЯТИЕ №13 . Антитела. Реакции нейтрализации, преципитации. Иммунология
ЗАНЯТИЕ №14 . Система комплемента. Реакции иммунитета: гемолиза, бактериолиза,
связывания комплемента. Оценка иммунного статуса. стр. 20
ЗАНЯТИЕ №15 . Иммунитет. Динамика иммунного ответа. ИФА, РИА, РИФ. Реакция
ЗАНЯТИЕ №16 . Иммунопатология. Аллергия. Иммунодефициты. Иммунопрофилактика,
Итоговое занятие по теме «Иммунитет».
Инфекция. Роль микро- и макроорганизма в развитии инфекционного
процесса. Формы взаимодействия микро- и макроорганизма. Виды
инфекций. Биологический метод исследования.
Генетика микроорганизмов. Бактериофагия.
Список рекомендуемой литературы
ТЕМА : Устройство и оборудование микробиологической лаборатории. Правила работы. Систематика и номенклатура микроорганизмов. Морфология бактерий. Микроскопический метод исследования. Простые методы окраски.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории.
2. Знать устройство светового биологического микроскопа.
3. Научиться работать с иммерсионной системой микроскопа.
4. Научиться микроскопировать мазки, ознакомиться с правилами обращения с
культурами микробов, приготовлением мазков, окраска их простым методом.
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Международная классификация и таксономия микроорганизмов .
2. Основные морфологические формы бактерий.
3. Методы изучения морфологии и структуры бактерий.
4. Этапы приготовления мазков из агаровых и бульонных культур.
5. Назначение простых методов окраски.
6. Правила пользования микроскопом.
7. Иммерсионный объектив, его преимущества.
1. Лекционный материал.
2. Учебник «Микробиология» З.Н. Кочемасова, стр. 16-21.
3. «Практикум по медицинской микробиологии» С.А.Павлович, 1993, стр. 4-9, 19-23.
I/ Приготовление мазков из бульонной культуры стафилококка. Окраска метиленовой синью.
2/ Приготовление мазка агаровой культуры кишечной палочки. Окраска фуксином. З/ Микроскопия демонстрационных мазков: стрептококков.
4/ Микроскопия и зарисовка в альбом 3 препаратов.
окраска метиленовым синим
окраска метиленовым синим
I. Этапы приготовления мазков.
1. Приготовление мазка из агаровой культуры.
а\ На середину обезжиренного предметного стекла нанести петлей ка физиологического раствора.
б\ Внести стерильной петлей в каплю физиологического раствора агаровую культуру.
в\ Равномерно распределить культуру на предметном стекле в виде круга в диаметре 1- 1,5см.
г\ Простерилизовать петлю в пламени.
д\ Высушить мазок при комнатной температуре или для ускорения
е\ Зафиксировать мазок в пламени.
ж\ Окрасить мазок.
з\ Промыть водой.
и\ Высушить мазок.
к\ Нанести на мазок каплю иммерсионного масла.
л \ Микроскопия мазка.
2. Приготовление мазка из бульонной культуры.
а\ На середину обезжиренного предметного стекла нанести стерильной петлей или
распределить в виде мазка диаметром 1-1,5см. Далее см. выше пункты г-л.
II . Правила работы с иммерсионной системой микроскопа.
1. Поднять конденсор до уровня предметного столика и открыть ирис-диафрагму.
2. Глядя сбоку в верхнюю линзу конденсора, вращаяи зеркало, найти изображение источника света.
3. Установить иммерсионный объектив.
4. На предметный столик поместить препарат с каплей иммерсионного масла и закрепить
5. Под контролем глаза макровинтом опустить тубус до соприкосновения линзы объектива с каплей масла на препарате. Очень осторожно погрузить под контролем глаза линзу в масло, не доводя до соприкосновения со стеклом.
6. Глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до появления изображения в поле зрения.
7. Вращая микровинт не более, чем на 1/2 оборота, добиться четкого изображения.
8. После просмотра препарата макровинтом поднять тубус, нять препарат, протереть фильтровальной бумагой фронтальную линзу иммерсионного объектива, салфетку положить на предметный столик.
9. Перевести на малое увеличение и опустить тубус до упора.
ТЕМА : Морфология и структура прокариотов. Сложные методы окраски.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1.Освоить теоретический материал по теме занятия. Знать сущность и назначение сложных методов окраски: по Граму, по Бурри-Гинсу. Иметь представление о принципе люминесцентной микроскопии.
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Структура бактериальной клетки: обязательные и необязательные структуры.
2. Методы для изучения анатомии бактерий, значение.
3. Оболочка: строение, роль.
4. Принципы и сущность окраски по Граму.
5. Протопласт, сферопласт, L-формы бактерий.
6. Капсула бактерий, роль. Методы выявления капсул.
7. Нуклеоид, роль, методы обнаружения.
8. Принцип люминесцентной микроскопии.
1. Лекционный материал.
2. Учебник «Микробиология» З.Н.Кочемасова, 1984 г., стр.22-26.
3. «Практикум по медицинской микробиологии» С.А.Павлович, 1993, стр.6-8, 13-19.
I/ Приготовление мазков из смеси сарцины и кишечной палочки, окраска по Граму в модификации Синева.
2/ Микроскопия демонстрационных мазков с капсульными бактериями, окраска по БурриГинсу.
З/ Зарисовка двух препаратов
смесь E.coli и Sarcina flava
Капсула у бактерий
окраска по Граму
окраска по Бурри-Гинсу
4/ Микроскопия препарата, окрашенного акридиновым оранжевым для выявления нуклеоида.
5/ Просмотр слайдов.
Сложные и другие методы окраски:
1. Окраска по Граму.
раствором генцианового фиолетового дистиллированную воду на1–2 минуты, снимают фильтрованную бумагу, наносят раствор Люголя на 1–2 минуты, сливают его и наливают пипеткой этиловый спирт на30 секунд. Тщательно промывают водой, докрашивают водным раствором фуксина 1–2 минуты. Промывают и высушивают мазок.
ТЕМА : Морфология, структура прокариотов. Сложные методы окраски.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1. Освоить теоретический материал по теме занятия.
2. Продолжить знакомство с морфологией и структурой микроорганизмов .
3. Ознакомиться с техникой окраски по Нейссеру.
4. Ознакомиться с фазово-контрастной микроскопией.
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Цитоплазма и ее структуры, их назначение.
2. Методы для обнаружения зерен волютина.
3. Споры, условия и механизм образования.
4. Физико-химические особенности спор, значение спорообразования, методы обнаружения спор.
5. Жгутики, строение, роль.
6. Методы изучения подвижности.
7. Пили, их значение.
8. Принцип фазово-контрастной микроскопии.
1. Лекционный материал.
2. Учебник «Микробиология» З.Н. Кочемасова, стр.25, 26-29.
3. «Практикум по медицинской микробиологии» С.А.Павлович, 1993, стр.6-7, 17-19.
I/ Приготовление мазков из взвеси дрожжей, окраска по Нейссеру.
2/ Приготовление мазков из спорообразующей культуры, окраска генцианвиолетом. З/ Микроскопия демонстрационных мазков со спорами, окраска по Ожешко.
4/ Зарисовка трех препаратов:
Зерна волютина в дрожжах
окраска по Нейссеру
окраска по Ожешко
5/ Демонстрация препарата «раздавленная капля» в фазово-контрастном микроскопе для изучения подвижности.
ТЕМА : Морфология и структура прокариотов(спирохеты, риккетсии, хламидии, микоплазмы). Эукариоты (грибы и простейшие). Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1 день исследования).
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1. Знать теоретический материал по теме занятия.
2. Продолжить знакомство с морфологией и структурой микроорганизмов .
3. Знать отличия прокариотов и эукариотов.
4. Овладеть техникой посева петлей на чашку с мясопептонным агаром для получения роста отдельных изолированных колоний.
5. Ознакомиться с устройством термостата.
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Извитые формы бактерий. Спирохеты, строение, классификация, методы изучения их морфологии.
2. Риккетсии: морфология, структура, особенности физиологии .
3. Хламидии: морфология, структура, циклы развития.
4. Микоплазмы: морфология, особенности строения.
5. Грибы, морфология, строение, классификация.
6. Простейшие, строение, классификация.
1. Лекционный материал.
2. Учебник «Микробиология» З.Н. Кочемасова с соавт., с.32-42.
3. «Практикум по медицинской микробиологии» С.А.Павлович, 1993, стр. 21-23, 26-29.
1. Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов(спирохеты, хламидии, кандиды, плесени, простейшие).
Источник